توالی‌یابی کامل اگزوم – Whole Exome Sequencing (WES)

زمان آماده‌شدن نتیجه (TAT)

زمان معمول آماده‌شدن نتیجه آزمایش 3 تا 6 هفته کاری پس از دریافت نمونه قابل قبول و تکمیل اطلاعات بالینی است. در مواردی که بررسی‌های تکمیلی، تأیید واریانت، مطالعات خانوادگی یا تحلیل‌های بیشتر ضروری باشد، ممکن است زمان گزارش افزایش یابد.

تکنیک آزمایش

این آزمایش با استفاده از توالی‌یابی نسل جدید (Next-Generation Sequencing; NGS) و پلتفرم Illumina انجام می‌شود.

DNA ژنومی استخراج‌شده پس از آماده‌سازی کتابخانه و غنی‌سازی نواحی هدف، توالی‌یابی شده و داده‌های حاصل با استفاده از یک pipeline بیوانفورماتیکی مورد پردازش و تحلیل قرار می‌گیرند.

فرایند آنالیز شامل alignment توالی‌ها با ژنوم مرجع انسان، شناسایی واریانت‌ها (Variant Calling)، annotation، فیلتر و اولویت‌بندی واریانت‌ها بر اساس فنوتیپ بیمار و تفسیر بالینی آنها بر اساس شواهد علمی و پایگاه‌های معتبر است.

واریانت‌ها بر اساس استانداردها و توصیه‌های جاری ACMG/AMP و سایر دستورالعمل‌های معتبر مرتبط تفسیر و طبقه‌بندی می‌شوند.

نوع و شرایط نمونه

نمونه ارجح:

خون کامل در لوله EDTA
نمونه باید دارای مشخصات کامل و تطابق هویتی با فرم درخواست آزمایش باشد.
نمونه نباید لخته شده، به‌شدت همولیز شده یا از نظر حجم و کیفیت نامناسب باشد.
DNA استخراج‌شده با کیفیت و مقدار مناسب نیز در صورت تطابق با معیارهای پذیرش آزمایشگاه قابل قبول است.
سایر نمونه‌ها تنها در صورتی قابل پذیرش هستند که روش آزمایش برای آن نوع نمونه اعتبارسنجی شده باشد.

کیفیت و کمیت DNA قبل از انجام آزمایش ارزیابی می‌شود.

شرح آزمایش

توالی‌یابی کامل اگزوم یا Whole Exome Sequencing (WES) یک آزمایش جامع ژنتیکی برای بررسی بخش‌های کدکننده پروتئین در ژنوم انسان است. اگرچه اگزون‌ها تنها حدود 1 تا 2 درصد ژنوم را تشکیل می‌دهند، بخش قابل توجهی از واریانت‌های شناخته‌شده مرتبط با بیماری‌های تک‌ژنی در این نواحی یا مجاورت آنها قرار دارند.

در این آزمایش، اگزون‌های هزاران ژن به‌طور همزمان بررسی می‌شوند. سپس واریانت‌های شناسایی‌شده با توجه به علائم بالینی، سن شروع بیماری، سابقه خانوادگی، الگوی احتمالی وراثت و سایر اطلاعات پزشکی بیمار اولویت‌بندی و تفسیر می‌شوند.

WES به‌خصوص در شرایطی ارزشمند است که علائم بیمار با چندین بیماری یا ژن مختلف همپوشانی داشته باشد یا بررسی‌های ژنتیکی قبلی به تشخیص قطعی منجر نشده باشند.

این آزمایش به‌صورت Proband-only انجام می‌شود؛ یعنی در مرحله اولیه DNA خود بیمار مورد توالی‌یابی و تحلیل قرار می‌گیرد. در برخی موارد بررسی والدین یا سایر اعضای خانواده برای تعیین نحوه وراثت یا کمک به تفسیر یک واریانت توصیه خواهد شد.

موارد کاربرد و اندیکاسیون‌ها

شک به یک بیماری ژنتیکی یا تک‌ژنی بدون تشخیص مولکولی مشخص
ناهنجاری‌های مادرزادی متعدد
تأخیر تکاملی یا Developmental Delay
ناتوانی ذهنی (Intellectual Disability)
اختلالات طیف اوتیسم در صورت احتمال علت ژنتیکی
صرع و سایر اختلالات نورولوژیک با احتمال زمینه ژنتیکی
بیماری‌های عصبی ـ عضلانی
آتاکسی‌ها، نوروپاتی‌ها و اختلالات حرکتی ارثی
بیماری‌های متابولیک و میتوکندریایی مشکوک
بیماری‌های قلبی ارثی و کاردیومیوپاتی‌ها
بیماری‌های کلیوی ارثی
اختلالات اسکلتی و بافت همبند
اختلالات شنوایی یا بینایی با احتمال زمینه ژنتیکی
اختلالات غدد درون‌ریز با احتمال علت تک‌ژنی
اختلالات ایمنی ارثی
بیماری‌های پوستی ژنتیکی
بیماری‌های نادر یا سندرم‌هایی که تشخیص بالینی آنها مشخص نیست
وجود فنوتیپ پیچیده که می‌تواند توسط تعداد زیادی ژن ایجاد شود
سابقه خانوادگی قوی بیماری ژنتیکی بدون تشخیص مولکولی
منفی بودن آزمایش‌های ژنتیکی هدفمند قبلی
مواردی که انتخاب یک ژن یا پنل محدود ژنی بر اساس فنوتیپ بیمار امکان‌پذیر نیست
ACMG استفاده از Exome/Genome Sequencing را در کودکان دارای ناهنجاری‌های مادرزادی، تأخیر تکاملی یا ناتوانی ذهنی به‌عنوان آزمایش خط اول یا دوم، با توجه به شرایط بالینی، توصیه کرده است.

محدودیت‌ها

WES عمدتاً برای بررسی نواحی اگزونی و نواحی مجاور splice site طراحی شده و بخش عمده نواحی عمیق اینترونی و بین‌ژنی را بررسی نمی‌کند.
همه اگزون‌ها دارای پوشش یکسان نیستند و بعضی نواحی به علت GC بالا، توالی‌های تکراری، pseudogeneها یا homology بالا ممکن است پوشش کافی نداشته باشند.
نتیجه منفی WES وجود بیماری ژنتیکی را رد نمی‌کند.
برخی Copy Number Variants (CNVs) ممکن است بسته به pipeline مورد استفاده قابل شناسایی باشند، اما حساسیت WES برای CNV معمولاً معادل روش‌های اختصاصی مانند chromosomal microarray نیست.
این آزمایش برای تشخیص قابل اعتماد balanced translocations، inversions و بسیاری از structural variants پیچیده طراحی نشده است.
repeat expansionهایی مانند افزایش تکرار در FMR1، FXN، HTT و بسیاری از بیماری‌های ناشی از تکرار نوکلئوتیدی ممکن است با WES استاندارد شناسایی نشوند و به آزمایش اختصاصی نیاز دارند.
اختلالات ناشی از methylation، imprinting یا UPD ممکن است با WES استاندارد قابل شناسایی نباشند.
واریانت‌های میتوکندریایی ممکن است نیازمند آزمایش اختصاصی mtDNA باشند.
mosaicism با فراوانی آللی پایین ممکن است شناسایی نشود.
برخی deletion/duplicationهای بزرگ یا پیچیده ممکن است شناسایی نشوند.تفسیر واریانت‌ها وابسته به دانش علمی موجود در زمان انجام آزمایش است؛ بنابراین برخی واریانت‌ها ممکن است به‌صورت Variant of Uncertain Significance (VUS) گزارش شوند.
برخی ژن‌های بیماری‌زا یا ارتباط ژن ـ بیماری ممکن است در زمان انجام آزمایش هنوز شناخته نشده باشند.
عدم ارائه اطلاعات بالینی دقیق می‌تواند قدرت اولویت‌بندی و تفسیر واریانت‌ها را کاهش دهد.
WES آزمایش مناسبی برای رد تمام بیماری‌های ژنتیکی نیست و در بعضی شرایط WGS، CMA، MLPA، repeat-expansion analysis، methylation analysis یا سایر آزمایش‌های اختصاصی ممکن است لازم باشد.

حساسیت آزمایش

حساسیت تحلیلی WES برای SNVها و insertion/deletionهای کوچک در نواحی دارای پوشش کافی و کیفیت مناسب معمولاً بسیار بالا و می‌تواند بیش از 99٪ باشد؛ با این حال مقدار دقیق باید بر اساس validation آزمایشگاه و محدوده گزارش‌شده آزمایش تعیین شود.

این عدد با حساسیت بالینی یا Diagnostic Yield تفاوت دارد.

میزان دستیابی به تشخیص مولکولی با WES به فنوتیپ بیمار، سن، سابقه خانوادگی، نوع بیماری، کیفیت اطلاعات بالینی و انجام Proband-only یا Trio analysis بستگی دارد و در بسیاری از گروه‌های بیماران مشکوک به بیماری‌های مندلی، تشخیص قطعی تنها در بخشی از بیماران حاصل می‌شود.

بنابراین نتیجه منفی WES به معنی رد علت ژنتیکی بیماری نیست.

ویژگی آزمایش

ویژگی تحلیلی (Analytical Specificity) برای SNVها و indelهای کوچک در نواحی با کیفیت و پوشش کافی، در یک روش NGS به‌خوبی اعتبارسنجی‌شده، معمولاً بیش از 99٪ است.

مقدار دقیق Analytical Sensitivity و Analytical Specificity باید بر اساس validation، معیارهای QC و pipeline اختصاصی آزمایشگاه تعیین شود.

واریانت‌هایی که از نظر فنی یا بالینی نیازمند تأیید باشند ممکن است با یک روش مستقل مانند Sanger sequencing یا روش مناسب دیگر تأیید شوند.

کد معادل آزمایش در آمریکا

برای Whole Exome Sequencing بیمار (Proband) کد CPT اصلی مورد استفاده در آمریکا:

CPT 81415 — Exome sequence analysis; proband

کدهای مرتبط با بررسی اعضای خانواده، در صورت انجام:

CPT 81416 — Exome sequence analysis; each comparator exome (e.g., parents, siblings)

انتخاب نهایی CPT و نحوه billing باید بر اساس روش اعتبارسنجی‌شده آزمایشگاه، شرایط payer و آخرین مقررات کدگذاری آمریکا انجام شود.

بیماری‌ها و وضعیت‌های مورد بررسی

WES یک آزمایش مختص یک بیماری خاص نیست و می‌تواند هزاران ژن مرتبط با بیماری‌های انسانی را به‌طور همزمان بررسی کند. از مهم‌ترین گروه‌های بیماری قابل بررسی می‌توان به موارد زیر اشاره کرد:
بیماری‌های نورولوژیک و نورودژنراتیو ارثی
تأخیر تکاملی و ناتوانی ذهنی
اختلالات ژنتیکی مرتبط با اوتیسم
صرع‌های ژنتیکی
بیماری‌های عصبی ـ عضلانی
میوپاتی‌ها و دیستروفی‌های عضلانی
نوروپاتی‌های ارثی
آتاکسی‌های ژنتیکی
بیماری‌های متابولیک ارثی
اختلالات میتوکندریایی ناشی از ژن‌های هسته‌ای
بیماری‌های قلبی و کاردیومیوپاتی‌های ارثی
آریتمی‌های ارثی
بیماری‌های کلیوی ژنتیکی
اختلالات اسکلتی
بیماری‌های بافت همبند
اختلالات شنوایی ژنتیکی
بیماری‌های ارثی شبکیه و سایر بیماری‌های ژنتیکی چشم
اختلالات غدد درون‌ریز ارثی
نقص‌های اولیه سیستم ایمنی
بیماری‌های پوستی ژنتیکی
سندرم‌های ناهنجاری‌های مادرزادی
بیماری‌های نادر و تشخیص‌داده‌نشده
محدوده واقعی گزارش بر اساس ژن‌های دارای ارتباط معتبر با بیماری، کیفیت توالی‌یابی، فنوتیپ بیمار و سیاست گزارش‌دهی آزمایشگاه تعیین می‌شود.

پوشش بیمه

پوشش هزینه Whole Exome Sequencing به شرکت بیمه، نوع طرح بیمه، اندیکاسیون پزشکی، سابقه آزمایش‌های قبلی و معیارهای Medical Necessity بستگی دارد.

برخی بیمه‌ها WES را در بیماران دارای ناهنجاری‌های مادرزادی، تأخیر تکاملی، ناتوانی ذهنی، صرع، بیماری‌های نورولوژیک یا سایر شرایطی که احتمال بیماری ژنتیکی در آنها بالا است پوشش می‌دهند، به‌ویژه زمانی که آزمایش‌های استاندارد قبلی به تشخیص نرسیده باشند یا WES از نظر پزشکی نسبت به انجام متوالی چندین آزمایش هدفمند مناسب‌تر باشد.

پوشش بیمه تضمین‌شده نیست و ممکن است پیش از انجام آزمایش به Prior Authorization، مدارک پزشکی، شجره‌نامه، نتایج آزمایش‌های قبلی یا نامه Medical Necessity نیاز باشد.

بیمار باید پیش از انجام آزمایش، شرایط پوشش و میزان سهم پرداختی خود را با شرکت بیمه بررسی کند.